布鲁氏杆菌LPS制备 [复制链接]

布氏杆菌(BrucellaBlues)是一种细胞内寄生的革兰氏阴性需氧杆菌，可引起人畜共患的布氏杆菌病，人类布氏杆菌病的临床表现为发热，乏力，多汗，肌肉及骨关节疼痛，肝、脾、淋巴和睾丸肿大等，并可导致男性不孕不育，女性早产流产，严重者可丧失劳动能力。因其早起症状不明显，常因误诊而转变为慢性，反复发作长期不愈。

布鲁氏菌的外膜主要由脂多糖(LPS)组成,粗糙型布鲁氏菌结构中不存在光滑型布鲁氏菌

的LPS-O链结构。O链是菌体的抗原决定因子，是由3-5个糖基组成寡糖的重复结构，糖基的组成和结构在不同菌种、同种菌种的不同类群之间均有所不同，从而决定了其种、型特异性。其作为布氏杆菌表面最多的抗原结构，机体对其免疫应答产生的抗体是布氏杆菌病各种诊断方法中的主要检测抗体，因此提取纯的LPS抗原对于检测布鲁氏杆菌至关重要。

LPS粗提纯：

将灭活检验合格的布鲁氏杆菌悬液g离心10min,弃上清,对湿菌进行称重。每50g

湿菌加入ml蒸镏水,混匀后加热66℃,再加入ml66℃的90%(V/V)的苯酚溶液,在66℃

搅拌15min,4℃g离心15min,用长针头移取位于下层的酚相;

加入ml含1%饱和醋酸钠的冷甲醇沉淀LPS,4°C沉淀2h后g离心15min,弃去上清，沉淀中加80ml蒸馏水,4℃搅拌18h,g离心10min后收集上清，沉淀中继续加入

80ml蒸馏水，4℃搅拌2h,g离心15min后收集上清，与前面的上清合并。

在ml上清中加入8g三氯乙酸,搅伴10min后，g离心取上清。用蒸馏水透析ml/次，每次透析3h,透析4次。

LPS的纯化：

透析后的LPS中加入终浓度15微克/ml的蛋白酶K，55度消化3h,后室温消化24h,然后在ml去离子水中透析5次,3h/次。透析后用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和银染色法鉴定LPS的纯度。